本文基于GSEA和WGCNA分析幽门螺杆菌治疗机制。该研究系统地鉴定了25个关键通路，80个上调的中枢基因和11个候选介入微生物群，为幽门螺杆菌感染的发病机理提供了新的见解。
本文为南方医科大学公共卫生学院微生物学系范宏英教授团队研究成果，陈振辉为本文的第一作者。原文于年7月发表在JournalofCellularPhysiology。美格基因有幸负责本研究的基因组测序工作！
Bioinformaticidentificationofkeypathways,hubgenes,andmicrobiotafortherapeuticinterventioninHelicobacterpyloriinfection
通过生物信息学分析治疗幽门螺杆菌的关键途径、中心基因和微生物群落组成
作者：ZhenhuiChen,HuijuanChen,etal.
期刊：JournalofCellularPhysiology
研究方法：16S+转录组
时间：.07
影响因子：4.
DOI:10./jcp.
一、研究摘要
幽门螺杆菌感染的致病机制尚待确定，潜在的介入微生物群也才被发现。基因集富集分析（GSEA）用于从基因表达数据库中整合三个幽门螺杆菌感染的数据集，并鉴定出10个标志性基因集和35个健康和感染者之间存在差异的KEGG通路。对其中两个数据集进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）确定了三个关键基因共表达模块。这些模块包含54个富集的KEGG通路，其中25条与GSEA分析重叠，表明在幽门螺杆菌感染中潜在的重要作用。作者从三个关键模块中选择了个代表基因，用于幽门螺杆菌转录水平的体外验证，共验证80个上调基因。基于20个粘膜样品和SRA数据集微生物群的WGCNA显示了四个与幽门螺杆菌感染相关的微生落物群模块。负相关的模块包含11个微生物科。这些发现为幽门螺杆菌感染的发病机理提供了新的见解，并系统地鉴定了25个关键通路，80个上调的中枢基因和11个候选介入微生物群，以供进一步研究。
二、背景介绍
幽门螺杆菌，革兰氏阴性和感染性微需氧菌。它是最著名的人类病原体，然而，其基本致病机制仍是未知的，这是开发有效替代治疗策略的关键。
传统的RNA测序（RNA-seq）和微阵列研究主要侧重于单一基因间的相互作用，而忽略了系统的表达方式。GSEA和WGCNA被用来鉴定新的模式。GSEA评估先前定义的一组基因是否在两个生物学状态之间存在显着差异。WGCNA在系统水平上评估基因之间的相关性，并确定样品之间高度相关的基因表达模块。
这两种生物信息学方法已用于鉴定与几种临床相关感染相关的通路和中心基因。但尚未用于鉴定与幽门螺杆菌感染相关的通路和基因。在该研究中，作者基于GEO、SRA数据库和20个胃粘膜样本OTU表，利用WGCNA和GSEA对幽门螺杆菌感染中相关通路、代表基因、潜在的干预性微生物进行了系统鉴定。
三、材料和方法
1.来自于GEO和SRA的数据收集
从GEO数据库下载整合三个幽门螺杆菌感染者的mRNA数据集，GSE、GSE和GSE。GSE包括32种胃糜烂和健康的粘膜样本，被分类为HP+或HP-。GSE包括18个胃窦和胃粘膜样本，包括HP+、HP-或不确定。GSE包括32个胃粘膜活检标本，分为HP+或HP-。从SRA下载的SRP包含97个各种类型黏膜样本的16SrRNA数据，83个样本用于进一步研究。其他样品被淘汰。
2.GSEA和WGCNA分析
三个RNA数据集用于GSEA分析。转录组和16SrRNA的数据进行WGCNA分析。
3.幽门螺杆菌细胞感染及qPCR验证
用H.pyloriSydneyStrain1(SS1)菌株和GES-1细胞进行感染测定，提取RNA并进行实时定量qPCR验证。
4.活检标本和微生物组成分析
从20个胃窦活检样品中提取DNA并对V4区进行扩增测序，进行后续分析。
图1生物信息工作流程四、研究结果
1.GSEA和H.pylori感染关联
对三个GEO数据集进研究，鉴定与幽门螺杆菌感染有关的细胞通路。来自GSE和GSE富集的KEGG通路和标志性基因集如图2a、b所示。共有8个代表基因、24个代谢通路。两个数据集各自形成代谢通路网络图。
图2转录组的GSEA分析2.GSE、GSE基因共现网络和H.pylori感染关联
为检测基因转录水平与其对H.pylori感染的潜在综合影响之间的关系，对两个RNA数据集进行WGCNA分析。WGCNA在GSE中确定13个模块（图3c）。其中，洋红色模块与幽门螺杆菌感染高度正相关（n=个基因；图3d），没有负相关模块。洋红色模块中的基因构建网络图，顶部枢纽基因被鉴定为CD79a分子（CD79A；图3f）。
WGCNA在GSE中确定了26个模块(图4c)。棕色(r=0.70，p=1×10-5，n=基因)和青绿色(r=0.65，p=6×10-5，n=基因)模块与H.pylor感染呈高度正相关。且这些模块与胃炎分级密切相关。这两个模块之间的关系如图4e所示。对两个模块进行基因网络构建，枢纽基因被鉴定为SLAMF8和KLF12。
图3通过WGCNA鉴定GSE中与幽门螺杆菌感染相关的关键模块
3.关键通路鉴定和体外基因的验证
图5a显示了GSE、GSE三个关键模块中的常见KEGG通路。为验证生信分析产生的枢纽基因，选择GS值≥0.60的基因(n=)，使用幽门螺杆菌感染GES-1细胞进行体外验证。在感染后12小时和24小时，对基因转录进行实时PCR测定，共有80个基因上调，21个基因下调。对GSEA和WGCNA对共有通路的鉴定以及80个上调基因的验证表明分析的可靠性(图5b，c)。
图5关键通路鉴定和体外基因的验证4.HP+或HP-的细菌群落组成和OTU的共现网络
对HP+和HP-（n=10/每组）样本，进行16SrRNAV4区测序分析。由图6a可见，两组的微生物群是不同的。OTU的数量随着幽门螺杆菌感染而显著减少。不同个体的主要科都表现出不同的模式。HP+的粘膜样品微生物群始终以Helicobacteraceae为主(图6d)。Lefse分析用来确定在HP+和HP-间存在显着差异的细菌类群。图6e显示了两组中不同的科水平。结果表明HP+和HP-微生物群落组成完全不同，证明幽门螺杆菌对胃微生物生态的破坏作用。
为检测肠道微生物群不同成员之间的关系及其对幽门螺杆菌感染的潜在联合作用，基于OTU构建WGCNA网络，共鉴定出15个模块，包括一个高度正相关红色模块和一个高度负相关绿色模块。利用SRP的83个样本构建WGCNA网络。确定了四个模块，棕色(r=-0.65；p=2×10-11；n=26个OTU)和青绿色(r=-0.89；p=1×10-29；n=81个OTU)模块与幽门螺杆菌感染呈负相关。图6h显示了OTU分析中的红色和绿色模块与SRP分析中的棕色和青绿色模块之间的共有科。两个独立来源的微生物的WGCNA鉴定出与幽门螺杆菌感染呈负相关且在HP-组富集的11个细菌科（图6h）。
图6细菌群落组成分析和WGCNA五、结论
1.对转录组数据进行GSEA和WGCNA分析，共鉴定出25条关联代谢通路，表明这些通路在幽门螺杆菌感染中潜在的重要作用；
2.通过幽门螺杆菌转录水平的体外感染验证，共验证80个上调基因；
3.基于20个粘膜样品和SRA数据集WGCNA分析，鉴定了11个科水平候选介入微生物群，以供进一步研究。
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